HIKAYAT SP19

Jumat, 18 Januari 2019

Produksi Fragmen Rekombinan scFv Terhadap Asam 2,4-Dichlorophenoxyacetic Menggunakan Naïve Phage Library

Produksi Fragmen Rekombinan scFv Terhadap Asam 2,4-Dichlorophenoxyacetic Menggunakan Naïve Phage Library

Ringkasan Oleh: Septiawan Putranto, Feri Eko Hermanto, Nur Fitriana,

Asam 2,4-Dichlorophenoxyacetic atau dikenal dengan 2,4-D merupakan senyawa organik dengan rumus kimia C8H6Cl2O3. 2,4-D merupakan herbisida yang secara selectif dapat menyebabkan kematian pada gulma yang berdaun lebar, namun relatif tidak berpengaruh pada kelas rerumputan seperti sereal dan jenis rumput lainnya. Sejak tahun 1945 2,4-D secara komersil telah digunakan sebagai salah satu bahan aktif yang terdapat di dalam komposisi herbisida. Namun karena 2,4-D juga diketahui dapat menyebabkan kematian pada beberapa spesies tumbuhan sehingga dicari antibodi yang dapat menghancurkan senyawa tersebut. Pembuatan antibodi rekombinan merupakan metode yang banyak dipilih untuk menghasilkan jumlah antibodi yang banyak namun dalam waktu yang singkat. Salah satu metode dalam pembuatan antibodi rekombinan adalah melalui phage library display. Dalam metode ini fragment antibodi disisipkan ke dalam virus yang menginfeksi bakteri dikenal dengan bakteriofag. Fragmen antibodi akan terus diproduksi seiring dengan berjalannya proses replikasi virus. Selanjutnya dilakukan proses panning untuk mengetahui antibodi yang memiliki afinitas tinggi terhadap antigen.

Penelitian ini menggunakan bakteriofag yang berasal dari Griffin1.library. Tahap pertama dimulai dengan menyeleksi fragmen antibodi yang ditampilkan dari seluruh varian Griffin1.library dengan hapten 2,4-D. Seleksi diawali dengan mencampurkan suspensi bakteriofag dari library ke dalam sumuran yang telah diisi dengan 2,4-D sebagai coating conjugate dan diinkubasi. Setelah inkubasi, bakteriofag yang tidak berikatan dengan konjugat dibilas dengan PBS-T, sedangkan bakteriofag yang mempunyai reaktivitas terhadap konjugat 2,4-D dielusi dengan triethylamine agar interaksi antara fragmen antibodi yang ditampilkan oleh bakteriofag dengan konjugat 2,4-D terlepas. Bakteriofag hasil elusi kemudian diinfeksikan ke dalam bakteri E. coli TG1 yang sedang dalam tahap pertumbuhan eksponensial dalam media 2xTY broth. Setelah inkubasi, sel TG1 ditumbuhkan pada media agar TYE yang mengandung glukosa 1% dan ampicilin 100 µg/ml. Fungsi ampicilin adalah untuk menyeleksi antara sel TG1 yang berhasil terinfeksi oleh bakteriofag dengan TG1 yang tidak terinfeksi. Setelah inkubasi selama semalam, koloni di-streak ke media 2xTY yang mengandung ampicilin dan 15% gliserol sebagai preservatif. Agar partikel bakteriofag dapat terbentuk, ditambahkan M13KO7 helper phage pada saat rasio 20x pembelahan (bakteriofag/sel bakteri). Sel yang telah terinfeksi kemudian diresuspensi dalam media 2xTY yang mengandung 1% glukosa, ampicilin dan kanamycin. Penambahan kanamycin digunakan untuk menyeleksi sel yang telah terinfeksi bakteriofag library sekaligus phage helper M13KO7, karena plasmid phage helper M13KO7 mengandung gen resistan kanamycin. Partikel bakteriofag diisolasi dari sel menggunakan metode presipitasi dengan PEG.

Ekspresi dan produksi scFv yang reaktif terhadap 2,4-D dilakukan dengan menginfeksikan bakteriofag hasil seleksi ke sel E. coli HB2151 melalui vektor pHEN2. Jumlah protein fragment yang diproduksi dikuantifikasi berdasarkan metode indirect ELISA. Uji imunokimia juga dilakukan untuk mengetahui potensi interaksi klon scFv hasil produksi dengan beberapa senyawa yang mirip dengan 2.4-D. Fragmen antibodi spesifik 2,4-D hasil produksi kemudian dianalisis sekuennya berdasarkan DNA plasmid. Selain itu, dilakukan pula penentuan stabilitas fragment scFv dalam masa penyimpanan menggunakan larutan penyangga berikut ovalbumin dan protease inhibitor maupun larutan penyangga tanpa ovalbumin dan protease inhibitor. Stabilitas diukur berdasarkan jumlah persentase fraksi scFv aktif yang mampu berikatan dengan 2,4-D pada dua larutan penyimpanan yang berbeda tersebut selama 7 minggu.

Hasil seleksi dan produksi menunjukkan terdapat 3 klon scFv yang mampu reaktif terhadap 2,4-D, yaitu scFv-E1, E2 dan H7. Selain itu, pemanenan produksi fragmen scFv paling optimal adalah pada jam ke-6 pasca infeksi. Uji imunokimia menunjukkan ketiga klon scFv reaktif 100% terhadap 2,4-D, sekaligus mempunyai reaktivitas cukup tinggi pula pada 2,4-dichlorophenol (68-80%). Berdasarkan analisis sekuen, ketiga klon mempunyai homologi yang rendah, terutama pada bagian CDR, namun ketika dilihat menggunakan klasifikasi sekuen canonical menunjukkan bahwa ketiga klon tergolong pada kelas yang sama. Hal tersebut mengindikasikan bahwa perubahan residu asam amino pada masing-masing klon dapat dikompensasi tanpa mempengaruhi reaktivitas terhadap 2,4-D. Uji stabilitas menunjukkan bahwa penyimpanan selama 7 minggu di dalam suhu 4 °C merupakan kondisi yang paling optimal. Selain itu, keberadaan ovalbumin dan protease inhibitor mampu mengurangi penurunan afinitas akibat masa penyimpanan yang relatif lama.

Produk ini menunjukkan kemurnian 95% sebagai pita tunggal dengan ukuran sekitar 40-kDa pada densitogram SDS-PAGE. Produksi menghasilkan 200 µg fragmen scFv E1 murni per satu liter media kultur. Hasil yang ditemukan untuk antibodi scFv-E2 dan H7 sebanding dengan scFv-E1 dalam interval induksi yang sama. Dengan menggunakan antibodi scFv E1, E2 dan H7 rekombinan, ELISA dioptimalkan dalam pelarutan konjugat peleburan, hapten densitas konjugat dan pengenceran antibodi. Kurva kalibrasi yang diperoleh adalah cukup signifikan berkiar antara 5-50 ng/ml. Nilai IC50 untuk scFv E1, E2 dan H7 masing-masing adalah 10.2, 12.8 dan 14.5 ng/ml. Reaktivitas silang yang relatif tinggi diindikasikan juga untuk MCPA (24,9-38,0%) sedangkan reaksi dengan senyawa lainnya rendah.

KESIMPULAN

Antibodi fag yang diproduksi oleh recombinant library phage merupakan alternatif dari antibodi konvensional dan monoklonal. Herbisida 2,4-D dipilih sebagai model yang bertujuan untuk mengeksplorasi potensi naif Griffin1.library untuk menghasilkan antibodi fungsional untuk teknik immunoassay, terutama untuk ELISA. Pemilihan scFv dari library phage dilakukan oleh tube yang dikoating 2,4-D-protein dengan berbagai tingkat substitusi hapten. Strategi ini memungkinkan produksi tiga fragmen rekombinan dengan afinitas pengikatan pada herbisida hapten.

HUMANIZATION ANTIBODIES

HUMANIZATION ANTIBODIES

Antibodies are proteins with very important functions in the immune system. Thanks to their ability to recognize specific sequences from pathogens and other threats, antibodies can participate in the recognition and removal of foreign threats, such as virus and bacteria (Janeway et al.). Every human body is able to create millions of slightly different antibodies; every antibody has the ability to recognize one specific foreign antigen (Greger & Windhorst, 2013). Antibodies are, therefore, highly specific, which makes them very useful in the biomedical research field and in applied medicine. Antibodies are crucial in several screening and diagnosis methods, and in the last couple of decades they have emerged as treatment option for several diseases, including arthritis, cardiovascular disease, transplant rejection and cancer (Gura, 2002).

First generation antibodies come from mice, and since their use as therapeutic antibodies requires for them to be injected into the human body, researchers encountered two major problems: First, they elicit an immunogenic response, which, depending on its intensity, can be dangerous for the patient. Second, they can also elicit an anti-antibody response. In this case, the patient’s immune system destroys the therapeutic antibody, rendering them not effective (Stern & Herrmann, 2005). These two obstacles to therapeutic antibody use come from the fact that these antibodies, made in mice, are been recognized as foreign by the patient’s immune system (Winter & Milstein, 991).

In order to surpass these obstacles, antibodies can be made more human, so the immune system won’t attack them. Several strategies have been developed in order to achieve this “humanization” of antibodies: The first approach consisted on the creation of chimeric antibodies, which have a human part and a mice part. Afterward, antibodies were further manipulated in order to increase their human composition, and these antibodies are known as humanized antibodies (Carter, 2001). Currently, antibodies can also be fully human, thanks to the existence of genetically engineered transgenic mice (Hudson & Souriau, 2003).

Antibodies Source www.nature.com Antibodies are proteins created by cells from the immune system. Their main characteristic is their ability to recognize specific protein sequences from a variety of antigens (Janeway et al.). Nowadays, and since their use is common in medicine and research, it is possible to produce artificial antibodies in the laboratory.

An antibody is composed by the antigen binding fragment (Fab) and the crystallisable fragment (Fc). While the Fab fragment recognizes the antigen and can bind to it, the Fc is able to interact with other components of the immune system. A typical antibody has a Yshape composed of two heavy chains and two light chains. These chains form two fab arms with identical structures and are attached by the Fc domain.

The fab domains have two variable domains (Fv), giving the antibody its specificity in recognition. Each one of these variable domains has three hyper-variable regions, called Complementary Determining Regions (CDRs). The CDRs are distributed in the Fv among four less variable fragments (FRs). The CDRs are responsible for giving the antibody its specific antigen recognition site (Sheriff et al, 1987).

An antibody from a non-human species (a mice or rat, for example) can be modified in order to make it more similar to the antibodies produced by the human body. This is done by antibody humanization techniques, and the result is antibodies that are useful for therapeutic purpose (Hudson & Souriau, 2003). Antibodies created in mice have sequences that are different to those naturally occurring in the human body, which causes them to be immunogenic; the human body recognizes them as foreign. The subsequent immunological reaction they cause in the human body is potentially dangerous and in the long term it means they can be destroyed by the immune system before they exert their therapeutic effect. Humanization of antibodies, therefore, makes them safer and fitter to use for therapy.

A. Chimeric Antibodies

Chimeric antibodies were envisioned as a solution to the immunogenic challenges posed by mouse antibodies. Chimeric antibodies have a mixture of non-human (usually mouse) and human components: around two thirds of their structure is human, while the remaining third remains of animal composition. They are constructed by the fusion of the murine Fv region (responsible for binding the antigen) and the Fc region of a human antibody (Hoogenboom et al, 1996).

Chimeric antibodies started been developed in the 1980s, when recombinant technology applied in genetic research started being available. Recombinant technology allows for genetic material to be cut, spliced and put together from multiple sources. The creation of chimeric antibodies is possible through the use of recombinant DNA and genetic engineering. In live cells, mouse DNA encoding for the Fv region is merged with human DNA encoding for the Fc region. This way, a fusion gene is created that will be translated into a recombinant fusion protein (Fell & Folger-Bruce, 1993).

The final result is an antibody that has had the segments that made it recognizable as nonhuman, replaced. By the genetic replacement of the murine constant domain for a human Fc domain, the resulting antibody is recognized as human by the immune system and therefore they have a reduced risk of eliciting an adverse immune response (Harding et al, 2010).

Chimeric antibodies have better binding affinity and reduced immunogenicity compared to mouse antibodies; however, they are still immunogenic and can elicit an anti-immune and anti-antigen response. Their therapeutic effectiveness is still not optimal, because this immune response can eliminate them (Harding et al, 2010). Despite this, chimeric antibodies have been successful in the treatment of several diseases, particularly cancer. There are, currently, several of these chimeric antibodies available in the market for therapeutic use (Elvin, Couston & van der Walle, 2013). These kinds of drugs are recognized by their suffix: ximab.

B. Humanization Antibodies

The humanized antibodies were the next step after the creation and perfectioning of chimeric antobodies. They are created by grafting the CDRs regions from a mouse antibody onto a human Fv. A humanized antobody, then, contains CDR regions derived from the mouse that have been engrafted into the human sequence-derived Fv. This way, they have around 90% of human content (Winter & Harris, 1993).

These kinds of antibodies are designed and synthesized by the overlapping PCR method (Oliphant et al, 2005). Besides, specific mutations can be done in order to generate the desired antibody. The different chains of the antibody are generated and cloned into expression vectors, and then co.expressed in another cell culture, like COS cells. This process will generate the humanized version of the antibody, which will be found in the supernatant and can be quantified by ELISA. An analysis of the resulting antibody is made and in case it’s necessary changes can be done yu mutagenesis to make it more effective (Oliphant et al, 2005).

Humanized antibodies have less immunogenicity than chimeric antibodies and mouse antibodies. There are several of these types of antibodies in the market been used for therapeutic purposes (Lahrtz, 2015). These drugs are known by their suffix, zumab.

Currently, it is possible to create fully human antibodies, with no murine sequence. They can be produced in two ways: phage display technologies and transgenic mice (Winter, 1993). Phage display is a technique that uses bacteriophages (viruses that infect bacteria) to connect proteins. Antibodies will be displayed on the surface of phage by fusing the coding sequence of the Fv regions to one of the phage’s coat proteins (Deantonio, 2014).

Human antibodies can also be created by the use of transgenic mice. In this technique, the human immunoglobulin loci are introduced into the germ line of mice with inactivated antibody machinery. This way, the mouse will be able to generate high-affinity and fully human antibodies. The mice are presented with the antigen, the immunoglobulin transgenes undergo joining and they end up creating high affinity monoclonal antibodies (Jakobovits, 1995).

In 2005 was aprooved the first fully human antibody for therapy. It was an antibody against EGF. Since then, several other transgenic mice have been approved for the production of other fully human antibodies, known by their suffix, umab (Elvin, 2013) The genetically humanized mice are, therefore, a powerful tool for research and medical development.

REFERENCES:

1. Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M. J., & Shlomchik, M. J. (2001).Immunobiology: the immune system in health and disease (Vol. 2). London: Churchill Livingstone.

2. Greger, R., & Windhorst, U. (Eds.). (2013). Comprehensive human physiology: from cellular mechanisms to integration. Springer Science & Business Media.

3. Gura, T. (2002). Therapeutic antibodies: magic bullets hit the target. Nature,417(6889), 584-586.

4. Stern, M., & Herrmann, R. (2005). Overview of monoclonal antibodies in cancer therapy: present and promise. Critical reviews in oncology/hematology, 54(1), 11-29.

5. Winter, G., & Milstein, C. (1991). Man-made antibodies. Nature, 349(6307), 293-299.

6. Carter, P. (2001). Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies.Nature Reviews Cancer, 1(2), 118-129.

7. Sheriff, S., Silverton, E. W., Padlan, E. A., Cohen, G. H., Smith-Gill, S. J., Finzel, B. C., & Davies, D. R. (1987). Three-dimensional structure of an antibody-antigen complex. Proceedings of the National Academy of Sciences,84(22), 8075-8079.

8. Hudson, P. J., & Souriau, C. (2003). Engineered antibodies. Nature medicine,9(1), 129134.

9. Hoogenboom, H. R., Baier, M., Jespers, L. S., & Winter, G. P. (1996). U.S. Patent No. 5,565,332. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office.

10. Brüggemann, M., Winter, G. R. E. G., Waldmann, H. E. R. M. A. N., & Neuberger, M. S. (1989). The immunogenicity of chimeric antibodies. The Journal of experimental medicine, 170(6), 2153-2157.

11. Fell Jr, H. P., & Folger-Bruce, K. R. (1993). U.S. Patent No. 5,202,238. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office.

12. Harding, F. A., Stickler, M. M., Razo, J., & DuBridge, R. (2010, May). The immunogenicity of humanized and fully human antibodies: residual immunogenicity resides in the CDR regions. In MAbs (Vol. 2, No. 3, pp. 256-265). Taylor & Francis.

13. Elvin, J. G., Couston, R. G., & van der Walle, C. F. (2013). Therapeutic antibodies: market considerations, disease targets and bioprocessing.International journal of pharmaceutics, 440(1), 83-98.

14.Winter, G., & Harris, W. J. (1993). Humanized antibodies. Immunology today,14(6), 243246.

15. Oliphant, T., Engle, M., Nybakken, G. E., Doane, C., Johnson, S., Huang, L., … & Diamond, M. S. (2005). Development of a humanized monoclonal antibody with therapeutic potential against West Nile virus. Nature medicine, 11(5), 522-530.

16. Lahrtz, F. (2015). How to Successfully Patent Therapeutic Antibodies. Journal of biomolecular screening, 1087057114567457.

17. Deantonio, C., Cotella, D., Macor, P., Santoro, C., & Sblattero, D. (2014). Phage Display Technology for Human Monoclonal Antibodies. In Human Monoclonal Antibodies (pp. 277-295). Humana Press.

18. Jakobovits, A. (1995). Production of fully human antibodies by transgenic mice.Current Opinion in Biotechnology, 6(5), 561-566.

19. Elvin, J. G., Couston, R. G., & van der Walle, C. F. (2013). Therapeutic antibodies: market considerations, disease targets and bioprocessing.International journal of pharmaceutics, 440(1), 83-98.

ANALISIS KUALITAS SPERMA DAN PENGAMATAN HISTOLOGI TESTIS PADA TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus)

LAPORAN PRAKTIKUM

SPERMATOLOGI

“ANALISIS KUALITAS SPERMA DAN PENGAMATAN HISTOLOGI TESTIS PADA TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus)”

oleh:

Nama : Septiawan Putranto

NIM : 186090100111018

PROGRAM MAGISTER BIOLOGI

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2018

LAPORAN PRAKTIKUM

SPERMATOLOGI

“ANALISIS KUALITAS SPERMA”

oleh:

Nama : Septiawan Putranto

NIM : 186090100111018

PROGRAM MAGISTER BIOLOGI

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2018

KATA PENGANTAR

Puji syukur ke hadirat Allah SWT atas rahmat dan hidayah-Nya atas limpahan rahmat dan karunianya sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan ini. Shalawat dan salam tak lupa kita junjungkan kepada Nabi Muhammad SAW yang telah membawa kita dari jaman jahiliyah menuju kejaman yang terang benderang.

Dalam penyusunan laporan ini, penulis menyampaikan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada dosen pengampu mata kuliah dan pembimbing praktikum laboratorium. Oleh karena itu, penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya dan semoga Allah menerima dan meridhoi segala apa yang sudah di kerjakan dan semoga amal baiknya di nilai sebagai ibadah disisi Allah SWT. Amin

Saran, masukan maupun kritik dari pembaca sangat diharapkan agar pada edisi berikutnya dapat menjadi lebih baik. Akhir kata, laporan praaktikum spermatologi ini diharapkan dapat bermanfaat bagi seluruh sivitas akademika Jurusan Biologi Fakultas MIPA maupun pembaca lainnya.

Malang, 7 Desember 2018

Penulis

DAFTARISI

COVER......................................................................................................... i

KATA PENGANTAR................................................................................ ii

DAFTAR ISI................................................................................................ iii

BAB I: PENDAHULUAN.......................................................................... 1

1.1 Latar Belakang............................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah.......................................................................... 1

1.3 Tujuan............................................................................................ 1

1.4 Manfaat..........................................................................................

BAB II: TINJAUAN PUSTAKA............................................................... 2

2.1 Kerangka Konsep.........................................................................

2.2 Hipotesis.......................................................................................

BAB III: METODE PENELITIAN........................................................... 6

3.1 Waktu dan Tempat........................................................................ 6

3.2 Alat dan Bahan.............................................................................. 6

3.3 Langkah Penelitian........................................................................ 6

3.4 Analisis Data..................................................................................

BAB IV: HASIL DAN PEMBAHASAN................................................... 7

4.1 Hasil Pengamatan.......................................................................... 7

4.2 Analisis Prosedur........................................................................... 8

4.3 Pembahasan................................................................................... 8

BAB V: KESIMPULAN DAN SARAN.................................................... 10

5.1 Kesimpulan.................................................................................... 10

5.2 Saran.............................................................................................. 10

DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Infertilitas adalah tidak tercapainya kehamilan dari pasangan yang telah berhubungan seksual secara teratur tanpa menggunakan alat dan metode kontrasepsi apapun setelah menikah selama 12 bulan atau lebih. Banyak faktor yang mempengaruhi infertilitas, sehingga banyak pasangan tidak memiliki anak disebabkan infertilitas. Terdapat hampir 50 juta pasangan di suluruh dunia pada tahun 2010 yang mengalami masalah infertilitas dan 50% dianatarnya disebabkan faktor dari pria. Penelitian pada tahun 2000 di indonesia 3-4,5 juta dari 30 juta pasangan usia subur mengalami infertilitas. Faktor-faktor yang dapat menimbulkan infertilitas pada pria, dapat disebabkan oleh gangguan spermatogenesis, kelainan pada testis atau di luar testis, gangguan pada transportasi sperma akibat kelainan anatomi dari saluran-saluran yang dilewati sperma. Faktor lainnya yaitu perubahan gaya hidup, radiasi, faktor psikologis, faktor genetik, dan lain-lain.

Spermatozoa ( sperma) yang normal memiliki kepala dan ekor, di mana kepala mengandung materi genetik DNA, dan ekor yang merupakan alat pergerakan sperma. Sperma yang matang memiliki kepala dengan bentuk lonjong dan datar serta memiliki ekor bergelombang yang berguna mendorong sperma memasuki air mani. Kepala sperma mengandung inti yang memiliki kromosom dan juga memiliki struktur yang disebut akrosom. Akrosom mampu menembus lapisan jelly yang mengelilingi telur dan membuahinya bila perlu. Sperma diproduksi oleh organ yang bernama testis dalam kantung zakar. Hal ini menyebabkan testis terasa lebih dingin dibandingkan anggota tubuh lainnya. Pembentukan sperma berjalan lambat pada suhu normal, tapi terus-menerus terjadi pada suhu yang lebih rendah dalam kantung zakar.

Pada tubulus seminiferus testis terdapat sel-sel induk spermatozoa atau spermatogonium. Selain itu juga terdapat sel Sertoli yang berfungsi memberi makan spermatozoa juga sel Leydig yang terdapat di antara tubulus seminiferus. Sel Leydig berfungsi menghasilkan testosteron.

Spermatogonium berkembang menjadi sel spermatosit primer. Sel spermatosit primer bermiosis menghasilkan spermatosit sekunder. Spermatosit sekunder membelah lagi menghasilkan spermatid. Spermatid berdeferensiasi menjadi spermatozoa masak. Bila spermatogenesis sudah selesai, maka ABP (Androgen Binding Protein) testosteron tidak diperlukan lagi, sel Sertoli akan menghasilkan hormon inhibin untuk memberi umpan balik kepada hiposis agar menghentikan sekresi FSH dan LH. Kemudian spermatozoa akan keluar melalui uretra bersama-sama dengan cairan yang dihasilkan oleh kelenjar vesikula seminalis, kelenjar prostat, dan kelenjar Cowper. Spermatozoa bersama cairan dari kelenjar-kelenjar tersebut dikenal sebagai semen atau air mani. Pada waktu ejakulasi, seorang laki-laki dapat mengeluarkan 300 – 400 juta sel spermatozoa. Pada laki-laki, spermatogenesis terjadi seumur hidup dan pelepasan spermatozoa dapat terjadi setiap saat.

Pada akhir proses, terjadi pertumbuhan dan perkembangan atau diferensiasi yang rumit, tetapi bukan pembelahan sel, yaitu mengubah spermatid menjadi sperma yang fungsional. Nukleus mengecil dan menjadi kepala sperma, sedangkan sebagian besar sitoplasma dibuang. Sperma ini mengandung enzim yang memegang peranan dalam menembus membran sel telur.

1.2 Rumusan Masalah

Bagaimana cara analisis kualitas sperma?

1.3 Tujuan Penelitian

Untuk mengetahui cara analisis kualitas sperma.

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat setelah melaksanakan praktikum ini adalah agar dapat membantu pembaca, mahasiswa, dan peneliti biologi mempelajari dan mengetahui cara analisis kualitas sperma dengan peran dan struktur jaringan penyusun sistem genital maskulin seperti jaringan penyusun epididimis dan testis, serta normalitas, viabilitas, dan abnormalitas sperma.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kerangka Konsep

Secara skematis konsep penelitian digambarkan sebagai berikut:

Analisis kualitas sperma

Terdapat variasi kualitas sperma (normalitas, viabilitas, abnormalitas)

Menganalisis kualitas sperma tikus

Pengamatan variasi kualitas sperma

Sperma dari caudal epipidimis kanan

2.2 Hipotesis

Adanya variasi pada kualitas sperma mulai dari normalitas, viabilitas, dan abnormalitas.

BABA III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Hari, Tanggal : Jum’at, 16 November 2018

Waktu : 13.00 - selesai WIB

Tempat : Laboratorium BIOMOL

3.2 Alat dan Bahan

a. Alat

- Mikroskop

- Pipet tetes

- Cawan petri

- Kaca preparat

- Hemositometer

b. Bahan

- Sperma tikus

- Aquades

- Eosin

- PBS/NCl

3.3 Langkah Penelitian

- Menyediakan testis tikus

- Mengambil caudal epididimis tikus

- Dilarutkan dengan NCl 0,9 % = 2 ml

- Dicacahi/disayat

- Diambil menggunakan pipet

- Diteteskan pada pipet dibawah mikroskop dengan pengambilan 10 µl sperma

3.5 Analisis Data

Data-data hasil pengamatan akan dianalisis dan dihitung dengan menggunakan rumus menghitung konsentrasi dan rumus abnormalitas.

Menghitung Abnormalitas

Jenis sperma yang mengalami abnormal bisa dilihat dari kepala, leher, dan ekor dengan struktur morfologi yang tidak sempurna.

Untuk menghitung atau mendapatkan data sperma abnormalitas, bisa dilakukan dengan rumus:

Menghitung Konsentrasi

Menghitung konsentrasi tidak harus yang hidup, akan tetapi menghitung konsentrasi dapat dilakukan pada sperma baik yang hidup atau yang mati.

∑ sel absolut = BP x FP x ∑ sel x 10⁴

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Sperma diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 10x10. Pengukuran sperma dilakukan dengan menggunakan hemositometer. Adapun jumlah total sperma yang telah dukur dan yang terhitung adalah 420, jumlah total sperma yang abnormalitas adalah 127, dan jumlah sperma yang viabilitas 212. Motilitas dapat dilihat dari beberapa lapang pandang (4 – 5%), dan motilitas pada penelitian ini mencapai 30%.

Normalitas	Viabilitas	Abnormalitas

Gambar 1: Hasil pengamatan kualitas sperma secara normalitas, viabilitas, dan abnormalitas

Menghitung Konsentrasi

Menghitung konsentrasi tidak harus yang hidup, akan tetapi menghitung konsentrasi dapat dilakukan pada sperma baik yang hidup atau yang mati.

Tabel 1: jumlah dan lokasi keberadaan sperma pada kaca pengamatan

				2
				2
				6
				3
				3

∑ sel absolut = BP x FP x ∑ sel x 10⁴

= 5 x 50 x 16 x 10⁴

= 4000 x 10⁴

= 10⁷ / ml (1 jt sel / ml)

4.2 Pembahasan

Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan, jumlah total sperma yang telah dukur dan yang terhitung adalah 420, jumlah total sperma yang abnormalitas adalah 127, dan jumlah sperma yang viabilitas 212. Motilitas dapat dilihat dari beberapa lapang pandang (4 – 5%), dan motilitas pada penelitian ini mencapai 30%.

Semen segar yang digunakan pada penelitian ini merupakan hasil dari koleksi spesimen praktikum/riset di Laboratorium BIOMOL.

Hasil penelitian semen secara mikroskopis disajikan pada gambar 1. Gerakan massa sperma dinilai berdasarkan kecendrungan sperma bergerak ke satu arah yaitu +++ menunjukkan semen segar yang digunakan masih baik. Toelihere (1993) menjelaskan bahwa kualitas semen tergolong sangat baik jika gerakan massa spermatozoa (+++) terlihat gelombang-gelombang besar, banyak, gelap, tebal dan aktif bagaikan gumpalan awan hitam yang bergerak cepat berpindah-pindah, dan tergolong baik jika gerak massa spermatozoa (++) apabila terlihat gelombang-gelombang kecil, tipis, kurang jelas, dan bergerak lamban sedangkan gerakan individu mencerminkan daya hidup sperma dengan rata-rata yang berguna untuk menilai fertilitas pejantan dengan rata-rata yaitu 80%. Nilai tersebut menunjukkan bahwa rata-rata motilitas semen segar sapi masih baik. Salisbury dan Denmark (1985) menjelaskan bahwa persentase gerakan individu minimal 70% semen segar dikatakan normal apabila semen tersebut mengandung spermatozoa yang memperlihatkan daya gerak aktif dan gerakan bergelombang dan konsentrasi semen segar sapi bali 1000 juta sel sperma / ml semen.

Penurunan persentase hidup spermatozoa terjadi disaat penambahan level NaCl yang makin tinggi, hal ini menunjukkan bahwa daya tahan hidup spermatozoa sangat baik. Dikatakan viabilitasnya bagus karena dibutuhkan konsentrasi larutan NaCl yang tinggi untuk bisa mematikan sel spermatozoa namun penurunan persentase hidup ini belum mencapai 0% karena kemungkinan NaCl juga merupakan larutan yang isotonis dengan plasma darah.

Dari hasil uji abnormalits sperma, jumlah sperma yang abnormal adalah sebanyak 127 sperma, jumlah total sperma sebanyak 420 sperma, dan dikalikan dengan 100% sehingga menghasilkan persentase abnormalitas sebanyak 0,3023%.

Hasil uji konsentrasi, sperma yang diamati dibawah mikroskop dengan perhitungan menggunakan kaca benda terhitung; jumlah sperma yang berada pada baris dan kolom bagian pertama 1 yaitu sebanyak 3 sperma, jumlah sperma pada baris dan kolom yang ke 2 yaitu sebanyak 3 sperma, jumlah sperma pada baris yang ke 3 yaitu sebanyak 6 sperma, jumlah sperma pada baris yang ke 4 yaitu 2 sperma, dan jumlah sperma pada baris yang ke 5 yaitu sebanyak 2 sperma. Hal ini menunjukkan bahwa tingkat konsentrasi sperma berbeda-beda dan bervariasi.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

5.2 Saran

Untuk melengkapi dan menyempurnaan laporan ini, penulis mengharapkan saran agar kedepannya lebih baik lagi.

LAPORAN PRAKTIKUM

SPERMATOLOGI

“PENGAMATAN HISTOLOGI TESTIS PADA TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus)”

oleh:

Nama : Septiawan Putranto

NIM : 186090100111018

PROGRAM MAGISTER BIOLOGI

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2018

KATA PENGANTAR

Malang, 7 Desember 2018

Penulis

DAFTARISI

COVER......................................................................................................... i

KATA PENGANTAR................................................................................ ii

DAFTAR ISI................................................................................................ iii

BAB I PENDAHULUAN............................................................................ 1

1.1 Latar Belakang............................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah.......................................................................... 1

1.3 Tujuan............................................................................................ 1

1.4 Manfaat..........................................................................................

BAB II TINJAUAN PUSTAKA................................................................ 2

2.1 Kerangka Konsep.........................................................................

2.2 Hipotesis.......................................................................................

BAB III METODE PENELITIAN............................................................

3.1 Waktu dan Tempat........................................................................

3.2 Alat dan Bahan..............................................................................

3.3 Langkah Penelitian........................................................................

3.4 Analisis Data..................................................................................

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN....................................................

4.1 Hasil Pengamatan..........................................................................

4.2 Analisis Prosedur...........................................................................

4.3 Pembahasan...................................................................................

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.....................................................

5.1 Kesimpulan....................................................................................

5.2 Saran..............................................................................................

DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sistem genitalia merupakan alat reproduksi yang mempunyai peranan penting dalam usaha mempertahankan eksistensi jenis hewan dengan cara berkembang biak. Sistem genitalia dibedakan menjadi dua bagian yaitu genitalia maskulin dan genitalia feminin. Sistem genitalia maskulin terdiri atas testis, saluran, kelenjar dan bagian eksterna. Testis berupa glandula tubuler komplek yang dibungkus oleh kapsula fibrosa yang tebal (tunika albugenia) dan lapisan peritonium tunika vaginalis viseralis, yang berupa jaringan ikat kolagen yang miskin vasa darah dan elemen elastis. Tunika albugenia kaya akan vaskularisasi (stratum vaskuler). Testis, terdapat tubulus seminiferus yang dibungkus jaringan ikat halus (sel intertestial). Dinding tubulus seminiferus terdiri dari sel epithelium komplek yang terdiri atas 2 macam sel yaitu : Sel penyokong dan sel spermatogenik. Sel penyokong disebut sel sustentakulum atau sel sentroli, sedangkan sel spermatogenik dibagi menjadi beberapa berdasarkan morfologinya yaitu : spermatogonia, spermatosit primer dan sekunder, spermatid dan spermatozoa. Sel sertoli melekat pada lamina basalis dan sel spermatogenik dekat dengan lumen (Hurkat, 1976 ).

Sel sertoli berfugsi untuk melindungi sel sprematogenik yang sedang berkembang dan memberi nutrisi sel spermatogenik dan proses pelepasan spermatozoa yang sudah dewasa. Sel sertoli yang tampak mengalami mitosis, tetapi lebih tahan terhadap panas, radiasi dan beberapa agen toksik yang mudah merusak sel spermatogenik. Spermatogonia terdiri atas caput dan kauda. Kauda sendiri terdiri atas neck (leher), middle piece (bagian tengah), principal (bagian pokok) dan end piece (bagian ujung). Sel Interstitial atau sel leydig merupakan jaringan ikat halus yang membungkus testis, berisi serabut saraf. Fungsi sel leydig yaitu : mengatur aktivitas kelenjar prostat, memelihara tanda khas jantan dan mengatur aktivitas spermatogenesis yang dibantu oleh hormon FSH dan Hipofisis (Junqueira, 1995).

1.2 Rumusan Masalah

Bagaimana cara mengamati dan memahami struktur histologi dari organ reproduksi jantan pada testis tikus putih (Rattus norvegicus)?

1.3 Tujuan Penelitian

Praktikum ini bertujuan untuk mengamati dan memahami struktur histologi dari organ reproduksi jantan pada testis tikus putih (Rattus norvegicus)

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat setelah melaksanakan praktikum ini adalah agar dapat membantu pembaca, mahasiswa, dan peneliti biologi mempelajari peran dan struktur jaringan penyusun sistem Genital Maskulin dan Feminin seperti jaringan penyusun epididimis, teatis, serta ovarium dan dapat dimanfaatkan dalam riset mengenai patohistologi.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Saluran terdiri atas Tubuli rekti, Rete testis (terdapat dalam testis), Duktuli Efferentes Testis, Duktus epididimis (terdapat dalam epididimis), Duktus deferens, Urethra (pars pelvina dan pars penis). Tubuli rekti berupa saluran pendek pada lobuli testis dengan epitel kubus selapis pada membrana basalis. Rete testis berupa saluran atau rongga yang saling berhubungan dalam mediastinum testis, terdiri epitel pipih selapis dan pembuluh darah serta saraf. Duktuli efferentes memiliki epithel silindris sebaris dengan dua macam sel, yakni : sel basilia (kinocilia) dan sel tanpa silia dengan banyak butir sekreta di dalamnya, sel ini menunjukkan aktivitas bersekresi. Sekreta dari sel berperan dalam proses pendewasaan dari spermatozoa dalam epididimis. Epididimis atau anak buah pelir, secara anatomis terdiri atas caput, korpus dan kauda epididimis. Epididimis terdiri atas jaringan ikat tunika albuginea sebagai stroma dengan mengandung otot polos yang didalamnya terdapat saluran yang merupakan parenkhim, yakni duktulis efferentes dan duktus epididimis. Fungsi epididimis : Menyimpan sementara spermatozoa. Duktus Deferens berupa saluran tunggal yang keluar dari kauda epididimis. Duktus deferens dibagi menjadi dua bagian, yakni : bagian yang tidak berkelenjar (Duktus deferens) dan bagian yang berkelenjar (Ampulla). Funikulus Spermatikus berbentuk buluh, dibalut oleh peritonium, didalamnya terdapat duktus deferens, pembuluh darah, saraf dan berkas otot polos.Uretra mempunyai ukuran yang cukup panjang, berdasarkan letaknya dibagi menjadi Uretra pars prostatika, uretra pars pelvina dan uretra pars penis (Adnan, 2006).

Kelenjar Asesorius (Glandula genitales asesorius) mempunyai ciri-ciri : Kelenjar bermuara pada uretra, bagian stroma (kapsula jaringan ikat interstitial, trabekula, septa) sering terdapat otot polos, kontraksi otot tersebut dapat mendorong skreta, khususnya pada proses ejakulasi dan Kelenjar berbentuk tubulus bercabang dengan lobulasi cukup jelas, bagian ujung kelenjar yang meluas membentuk sinus koligentes sebagai penampang sekreta. Kelenjar asesorius dibagi menjadi empat yaitu : ampula, vesibulares, prostat dan bulbo uretralis. Bagian eksternal terdiri atas penis, prepusium dan skrotum. Penis dapat dibagi atas korpus dan glans. Korpus penis terdiri atas : Jaringan erektil korpus kavernosum penis, uretra yang dikelilingi oleh korpus kavernosum uretrae, muskuli bulbo-kavernosus dan retraktor penis. Prepusium terdiri atas dua bagian yakni : Bagian exsternal yang merupakan kelanjutan dari kulit abdomen disebut : Pars parietalis dan pars viseralis, keduanya bertemu pada orifisium preputi. Pars parietalis terlipat kedalam dan ke muka pada forniks dan menutup ujung penis sebagai pars viseralis. Skrotum terdiri atas integumentum kommunis dan tunika dartos. Kulit skrotum lebih tipis, rambut lebih sedikit dan kaya akan glandula. Terdapat glandula sebasea dan glandula kulit tubuler. Tunika dartos terdiri atas berkas otot polos yang arahnya tidak teratur serta serabut kolagen dan elastis (Bresnick, 2003).

2.1 Kerangka Konsep

Secara skematis konsep penelitian digambarkan sebagai berikut:

Analisis kualitas sperma

Terdapat variasi kualitas sperma (normalitas, viabilitas, abnormalitas)

Menganalisis kualitas sperma tikus

Pengamatan variasi kualitas sperma

Sperma dari caudal epipidimis kanan

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Hari, Tanggal : Jum’at, 23 November 2018

Waktu : 13.00 - selesai WIB

Tempat : Laboratorium BIOMOL

3.2 Alat dan Bahan

- Testis

- Mikroskop

- Kaca benda

- Eosin

- Pipet tetes

- Cawan petri

3.3 Langkah Penelitian

- Mengambil testis tikus

- Diletakkan di cawan petri

- Disayat

- Diberikan pewarna eosin

- Diambil dengan pipet tetes dan diletakkan di kaca benda

- Diamati dibawah mikroskop dan dianalisis dengan aplikasi

3.4 Analisis Data

Analisis data dilakukan dengan aplikasi dan literatur yang telah didiskusika dengan asisten alboratorium.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Berdasarkan hasil pengamatan, pada gambar 1 dan gambar 2 adalah tampang pengamatan setelah perlakuan dan setelah dikalibrasi.

Gambar 1: Tampang pengamatan setelah perlakuan

Kalibrasi 200x	Kalibrasi 400x

Gambar 2: kalibrasi

4.2 Analisis Prosedur

- Menyediakan alat dan bahan

- Diberikan perlakuan

- Diamati dengan mikroskop

- Dan dianalisis dengan menggunakan aplikasi Optilab Advice.

4.3 Pembahasan

Berdasarkan hasil pengamatan pada preparat penampang melintang epididimis pada perbesaran 400X terlihat adanya bagian-bagian epididimis seperti stereocilia, epitel pseudostratified columnar ciliated, fibre muscle, spermatozoa dan lamina propia. Lumen epididymis hanya dilapisi oleh satu macam sel yaitu sel berambut silia yang tidak bergerak, karena silianya tidak bergerak maka sel-sel ini disebut stereo silia. (Sukra, 2000).

Epididymis merupakan pipa panjang dan berkelak-kelok yang menghubungkan vasa eferensia pada testis dengan ductus deferens (vas deferens). Epidydimis berperan sebagai tempat untuk pemasakan spermatozoa sampai pada saatspermotozoa dikeluarkan dengan ejakulasi (Frandson,1992).

Spermatozoa bergerak dari tubulus seminiferus lewat ductus deferens menuju ke kepala epididymis. Spermatozoa belum masak ketika meninggalkan testikel dan harus mengalami periode pemasakan di dalam epididymis sebelum mampu membuahi ovum. (Blakely dan David,1998).

Menurut Wahyuni (2012) Epididymis merupakan saluran spermatozoa yang panjang dan berbelit, terbagi atas kaput, korpus, dan kauda epididimidis, melekat erat pada testis dan dipisahkan oleh tunika albugeni. Organ tersebut berperan penting pada proses absorpsi cairan yang berasal dari tubuli seminiferi testis, pematangan, penyimpanan dan penyaluran spermatozoa ke duktus deferens sebelum bergabung dengan plasma semen dan diejakulasikan ke dalam saluran reproduksi betina.

Epididymis mempunyai empat fungsi utama yaitu pengankutan atau transportasi, konsentrasi atau pengen talan maturasi dan penyimpanan spermatozoa. Pengankutan spermatozoa diangkut dari rete testis keductuli efferents testis oleh tekanan cairan didalam testis. Pengentalan spermatozoa dari suspense sperma encer yang berasal dari testis dengan konsentrasi 25.000 sampai 350.000 sel per mm3, air diresorbsi kedalam sel-sel epitel terutama pada caput. Pematangan spermatozoa mungkin dicapai atas pengaruh sekresi dari sel-sel epithel. Spermatozoa dari bagian cauda epididymis telah memiliki kemampuan membuahi oosit yang sama baiknya dengan spermatozoa hasil ejakulasi. Penyimpanan terjadi di cauda Epididymis. Konsentrasi spermatozoa sangat tinggi dan lumuen ductus tersebut relative lebih luas. Setengah dari jumlah spermatozoa disimpan didalam cauda yang membentuk seperempat dari panjang saluran epididymis. Waktu yang dibutuhkan untuk perjalanan spermatozoa melalui epididymis bervariasi dan tergantung pada kondisinya tetapi mungkin tidak kurang dari 14 hari pada semua golongan hewan (Feradis,2010).

Berdasarkan hasil pengamatan pada preparat penampang melintang testis pada perbesaran 400X terlihat adanya bagian-bagian testis seperti tunika albuginia, sel leydig, lamina propia, spermatozoa, spermatid, spermatogonium (2n), sel sertoli, spermatosit primer dan spermatosit sekunder.

Di bawah kulit scrotum terdapat tunica dartos, suatu selubung yang terdiri dari jaringan fibroelastik dan otot licin. Di bagian tengah (sepanjang raphe scroti) membentuk septum scroti yang memisahkan scrotum dalam sebuah kantong yang terpisah. Lapisan berikutnya dalah tunica vaginalis communis suau fascia scrotalis tebal berwarna putih yang mengelilingi ke dau tengahan scrotum secara terpisah, dan di bagian tengah di selubungi oleh lapisan parietal, processus vaginalis, suatu evaginasi dari peritonium (Feradis,2010).

Skrotum dengan otot–otot licinnya, lapisan fibrosa dan kulit berfungsi menunjang dan melindungi testes dan epididymis dan mempertahankan suhu yang lebih rendah daripada suhu badan yang diperlukan agar spermatogenesis berlangsung secara normalSuhu testes 5 sampai 6^oc di bawah suhu badan. Terdapat mekanisme yang berbeda yang bekerja secara terpisah sehingga pengaturan suhu tersebut dapat berhasil. Suhu dingin, otot-otot cremaster dapat menarik scrotum sehingga suhu testes dapat dipertahankan hangat. Pada suhu panas otot tersebut mengendur dan testes turun menjauhi tubuh sehingga memungkinkan pelepasan panas hingga suhu testes menjadi lebih dingin. Otot lain yaitu tunica dartos yang mengelilingi kulit scrotum dapat mengerut atau mengendorkan permukaan scrotum dan hal ini akan memperluas permukaan scrotum sehingga mempengaruhi kecepatan hilangnya panas (Feradis,2010).

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Sistem genitalia merupakan alat reproduksi yang mempunyai peranan penting dalam usaha mempertahankan eksistensi jenis hewan dengan cara berkembang biak. Pada pengamatan sistem genital maskulin yang diamati adalah bagian epididimis dan testis. Pada epididimis memiliki bagian-bagian seperti stereocilia, epitel pseudostratified columnar ciliated, fibre muscle, spermatozoa dan lamina propia, sedangkan testis memiliki bagian-bagian seperti tunika albuginia, sel leydig, lamina propia, spermatozoa, spermatid, spermatogonium (2n), sel sertoli, spermatosit primer dan spermatosit sekunder.

5.2 Saran

Untuk melengkapi dan menyempurnaan laporan ini, penulis mengharapkan saran agar kedepannya lebih baik lagi.

DAFTAR PUSTAKA

Adnan dan Pagarra, Halifah. 2010. Struktur Hewan. Makassar: Jurusan Biologi
FMIPA UNM.

Amenta, peter S, 1990. Histologi dan Embriologi. Bandung: ITB.

Bevelander, Gerrit. 1988. Dasar–Dasar Histologi Edisi Kedelapan. Jakarta: Erlangga.

Betibops.2014.http://www.histology.world.com/photoalbum/displayimage.php?album=59&pid=3564#top_display_media. Diakses tanggal 6 Desember 2018.

Bresnick, Stephen. 2003. Intisari Biologi. Jakarta: Hipokrates.

Bracegirdle, Brian., Freeman.H.W.1970. An Atlas Histology.

Blakely, J and David.H.Bade. 1998. Ilmu Peternakan. Gadjah Mada University Press. Yogjakarta.

Bontocina. 2009. http://anatomytopics.wordpress.com//01/01/31-the-anatomy-histology-and-development-of-the-ovary/. Diakses tanggal 6 Desember 2018.

Dellman, Dieter, H., and Brown, Esther M. 1989. Buku Teks Histologi Veteriner, edisi ketiga, hal 108. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta.

Frandson, R.D.1992. Anatomi dan Fisiologi Ternak. Edisi Keempat. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Feradis. 2010. Reproduksi Ternak. Alfabeta. Bandung.

Hurkat, P. and Mathur. 1976., A Text Book of Animal Physiology. S Chand and Co. Ltd., New Delhi.

Jamilatun.2011.http://jamilatunhidayah.duniakuhidupmu.blogspot.com/2011_12_01_archive.html. Diakses tanggal 6 Desember 2018.

Junquiera, Carlos L., Carnerro Jote, Kelley Robert V. 1995. Histologi Dasar. Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Kumar, Robin. 2002. Ovarium dalam Buku Ajar Patologi II Edisi 4. Jakarta: EGC.

Lesson paparo, alih bahasa dr Jon Tambayon.1991. Buku ajar Histologi. Buku penerbit kedokteran EGC : Jakarta.

Sukra, Y. 2000. Wawasan Ilmu Pengetahuan Embrio ; Benih Masa Depan. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional : Jakarta.

Udel.2014.http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/wagnerart/anaglyphpage/anaglyph.html. Diakses tanggal 6 Desember 2018.

Yovita. 2014. http://yovitayudith.blogspot.com/. Diakses tanggal 6 Desember 2018.