Produksi Fragmen Rekombinan scFv Terhadap Asam 2,4-Dichlorophenoxyacetic Menggunakan Naïve Phage Library

Produksi Fragmen Rekombinan scFv Terhadap Asam 2,4-Dichlorophenoxyacetic Menggunakan Naïve Phage Library

Ringkasan Oleh: Septiawan Putranto, Feri Eko Hermanto, Nur Fitriana,

Asam 2,4-Dichlorophenoxyacetic atau dikenal dengan 2,4-D merupakan senyawa organik dengan rumus kimia C8H6Cl2O3. 2,4-D merupakan herbisida yang secara selectif dapat menyebabkan kematian pada gulma yang berdaun lebar, namun relatif tidak berpengaruh pada kelas rerumputan seperti sereal dan jenis rumput lainnya. Sejak tahun 1945 2,4-D secara komersil telah digunakan sebagai salah satu bahan aktif yang terdapat di dalam komposisi herbisida. Namun karena 2,4-D juga diketahui dapat menyebabkan kematian pada beberapa spesies tumbuhan sehingga dicari antibodi yang dapat menghancurkan senyawa tersebut. Pembuatan antibodi rekombinan merupakan metode yang banyak dipilih untuk menghasilkan jumlah antibodi yang banyak namun dalam waktu yang singkat. Salah satu metode dalam pembuatan antibodi rekombinan adalah melalui phage library display. Dalam metode ini fragment antibodi disisipkan ke dalam virus yang menginfeksi bakteri dikenal dengan bakteriofag. Fragmen antibodi akan terus diproduksi seiring dengan berjalannya proses replikasi virus. Selanjutnya dilakukan proses panning untuk mengetahui antibodi yang memiliki afinitas tinggi terhadap antigen.

Penelitian ini menggunakan bakteriofag yang berasal dari Griffin1.library. Tahap pertama dimulai dengan menyeleksi fragmen antibodi yang ditampilkan dari seluruh varian Griffin1.library dengan hapten 2,4-D. Seleksi diawali dengan mencampurkan suspensi bakteriofag dari library ke dalam sumuran yang telah diisi dengan 2,4-D sebagai coating conjugate dan diinkubasi. Setelah inkubasi, bakteriofag yang tidak berikatan dengan konjugat dibilas dengan PBS-T, sedangkan bakteriofag yang mempunyai reaktivitas terhadap konjugat 2,4-D dielusi dengan triethylamine agar interaksi antara fragmen antibodi yang ditampilkan oleh bakteriofag dengan konjugat 2,4-D terlepas. Bakteriofag hasil elusi kemudian diinfeksikan ke dalam bakteri E. coli TG1 yang sedang dalam tahap pertumbuhan eksponensial dalam media 2xTY broth. Setelah inkubasi, sel TG1 ditumbuhkan pada media agar TYE yang mengandung glukosa 1% dan ampicilin 100 µg/ml. Fungsi ampicilin adalah untuk menyeleksi antara sel TG1 yang berhasil terinfeksi oleh bakteriofag dengan TG1 yang tidak terinfeksi. Setelah inkubasi selama semalam, koloni di-streak ke media 2xTY yang mengandung ampicilin dan 15% gliserol sebagai preservatif. Agar partikel bakteriofag dapat terbentuk, ditambahkan M13KO7 helper phage pada saat rasio 20x pembelahan (bakteriofag/sel bakteri). Sel yang telah terinfeksi kemudian diresuspensi dalam media 2xTY yang mengandung 1% glukosa, ampicilin dan kanamycin. Penambahan kanamycin digunakan untuk menyeleksi sel yang telah terinfeksi bakteriofag library sekaligus phage helper M13KO7, karena plasmid phage helper M13KO7 mengandung gen resistan kanamycin. Partikel bakteriofag diisolasi dari sel menggunakan metode presipitasi dengan PEG.  

Ekspresi dan produksi scFv yang reaktif terhadap 2,4-D dilakukan dengan menginfeksikan bakteriofag hasil seleksi ke sel E. coli HB2151 melalui vektor pHEN2. Jumlah protein fragment yang diproduksi dikuantifikasi berdasarkan metode indirect ELISA. Uji imunokimia juga dilakukan untuk mengetahui potensi interaksi klon scFv hasil produksi dengan beberapa senyawa yang mirip dengan 2.4-D. Fragmen antibodi spesifik 2,4-D hasil produksi kemudian dianalisis sekuennya berdasarkan DNA plasmid. Selain itu, dilakukan pula penentuan stabilitas fragment scFv dalam masa penyimpanan menggunakan larutan penyangga berikut ovalbumin dan protease inhibitor maupun larutan penyangga tanpa ovalbumin dan protease inhibitor. Stabilitas diukur berdasarkan jumlah persentase fraksi scFv aktif yang mampu berikatan dengan 2,4-D pada dua larutan penyimpanan yang berbeda tersebut selama 7 minggu.

Hasil seleksi dan produksi menunjukkan terdapat 3 klon scFv yang mampu reaktif terhadap 2,4-D, yaitu scFv-E1, E2 dan H7. Selain itu, pemanenan produksi fragmen scFv paling optimal adalah pada jam ke-6 pasca infeksi. Uji imunokimia menunjukkan ketiga klon scFv reaktif 100% terhadap 2,4-D, sekaligus mempunyai reaktivitas cukup tinggi pula pada 2,4-dichlorophenol (68-80%). Berdasarkan analisis sekuen, ketiga klon mempunyai homologi yang rendah, terutama pada bagian CDR, namun ketika dilihat menggunakan klasifikasi sekuen canonical menunjukkan bahwa ketiga klon tergolong pada kelas yang sama. Hal tersebut mengindikasikan bahwa perubahan residu asam amino pada masing-masing klon dapat dikompensasi tanpa mempengaruhi reaktivitas terhadap 2,4-D. Uji stabilitas menunjukkan bahwa penyimpanan selama 7 minggu di dalam suhu 4 °C merupakan kondisi yang paling optimal. Selain itu, keberadaan ovalbumin dan protease inhibitor mampu mengurangi penurunan afinitas akibat masa penyimpanan yang relatif lama.

Produk ini menunjukkan kemurnian 95% sebagai pita tunggal dengan ukuran sekitar 40-kDa pada densitogram SDS-PAGE. Produksi menghasilkan 200 µg fragmen scFv E1 murni per satu liter media kultur. Hasil yang ditemukan untuk antibodi scFv-E2 dan H7 sebanding dengan scFv-E1 dalam interval induksi yang sama. Dengan menggunakan antibodi scFv E1, E2 dan H7 rekombinan, ELISA dioptimalkan dalam pelarutan konjugat peleburan, hapten densitas konjugat dan pengenceran antibodi. Kurva kalibrasi yang diperoleh adalah cukup signifikan berkiar antara 5-50 ng/ml. Nilai IC50 untuk scFv E1, E2 dan H7 masing-masing adalah 10.2, 12.8 dan 14.5 ng/ml. Reaktivitas silang yang relatif tinggi diindikasikan juga untuk MCPA (24,9-38,0%) sedangkan reaksi dengan senyawa lainnya rendah.

KESIMPULAN

Antibodi fag yang diproduksi oleh recombinant library phage merupakan alternatif dari antibodi konvensional dan monoklonal. Herbisida 2,4-D dipilih sebagai model yang bertujuan untuk mengeksplorasi potensi naif Griffin1.library untuk menghasilkan antibodi fungsional untuk teknik immunoassay, terutama untuk ELISA. Pemilihan scFv dari library phage dilakukan oleh tube yang dikoating 2,4-D-protein dengan berbagai tingkat substitusi hapten. Strategi ini memungkinkan produksi tiga fragmen rekombinan dengan afinitas pengikatan pada herbisida hapten.